Golem (doista golem) uspjeh postigla je tehnika koja stanice povećava do divovskih razmjera kako bi se otkrili i najsitniji detalji. Stručnjaci koriste polimer sličan superapsorbirajućim materijalima koji se primjenjuju u pelenama i time povećavaju volumen bioloških uzoraka na milijardu puta od izvornog – 1000 puta u svakoj dimenziji. Ovakvim „napuhavanjem” jedna bi se stanica mogla povećati na veličinu mišjeg mozga, a uzorak veličine sitnog novčića na olimpijski bazen.
Koristeći tehniku, stručnjaci mogu uz pomoć klasičnih svjetlosnih mikroskopa prikazati položaj aminokiselina (gradivnih elemenata proteina) u proteinima i sitnim molekulama zvanima peptidi. Metoda je opisana u preprintu objavljenom početkom mjeseca na stranici bioRxiv, u članku. Ranije se tako detaljno promatranje molekula obično provodilo skupim i složenim tehnikama, poput krioelektronske mikroskopije (cryo-EM) i rendgenske kristalografije.
„To je demokratizacija strukturne biologije”
– kaže koautor studije Silvio Rizzoli, neuroznanstvenik i stručnjak za snimanje na Sveučilišnom medicinskom centru u Göttingenu (UMG). „To zaista omogućuje temeljni opis same biti proteina”, dodaje jedna od koautorica, Helena Hu, biomedicinska inženjerka s Massachusetts Institute of Technology (MIT).
Ekspanzijska mikroskopija
Zakoni fizike ograničavaju optičku razlučivost svjetlosnih mikroskopa: objekti na udaljenosti manjoj od otprilike 200 nanometara ne mogu se međusobno razlikovati. „Superrazlučive” tehnike svjetlosne mikroskopije – koje se obično oslanjaju na optičke trikove i skupu opremu – spustile su tu granicu razlučivosti ispod 10 nm.
Edward Boyden, neuroinženjer s MIT-a i koautor studije, i njegovi su kolege 2015. razvili alternativnu metodu kojom se iznimno visoka razlučivost može postići klasičnim fluorescentnim svjetlosnim mikroskopima. Istraživači su uz pomoć hidrogela koji bubri povećali volumen tkivnih uzoraka otprilike četverostruko u svim smjerovima. Time su se stanične komponente udaljile jedna od druge, što je poboljšalo razlučivost.
Od tada su istraživači Boydenovu metodu nazvanu „ekspanzijska mikroskopija” neprestano usavršavali napuhavanjem uzoraka na sve veći volumen, no činilo se da je širenje izvedivo uglavnom do otprilike 20-struko povećanje. Kako bi postigli još veću veličinu, istraživači su razvili novi recept hidrogela kojim su uzorke dodatno proširili. Tim je uz to primijenio i ekspanzijsku mikroskopsku metodu nazvanu ONE mikroskopija za prikaz proteinskih struktura svjetlosnim mikroskopom.
Pročišćene proteine vezali su za hidrogel, a zatim ih enzimima ili toplinom razgradili, tako da su se mogli širiti uz očuvanje prostorne strukture.
Divovski proteini
Pri tako postignutom 1000-strukom širenju istraživači su označili nekoliko od devet aminokiselina koje čine peptid nazvan mCLING. Zatim su fluorescentnim mikroskopom snimili međusobni položaj gradivnih elemenata. Mjerenja su bila u skladu s mCLING strukturama dobivenima računalnim simulacijama.
Metoda je otkrila i strukturu proteina zvanog nanotijelo (umanjena inačica protutijela), kao i položaj nekih njegovih aminokiselina. Osim toga, istraživači su tehnikom prikazali i ranije utvrđenu strukturu zelenog fluorescentnog proteina (GFP), jednog od temeljnih alata u biotehnologiji za označavanje drugih proteina.
Prema procjeni istraživača, njihov model GFP-a – rekonstruiran iz nekoliko tisuća snimaka – postiže razlučivost od otprilike 1,2 nm, tj. 12 ångströma. To zaostaje za strukturom GFP-a od 1,9 ångströma određenom rendgenskom kristalografijom, dostupnom u javnim repozitorijima, kao i za razinom detalja koju stručnjaci redovito postižu krioelektronskim mikroskopskim pretragama.
No kako kaže Ali Shaib, stručnjak za nanoskope na UMG-u i koautor studije, zahvaljujući metodološkim poboljšanjima u još neobjavljenom pokusu uspjelo se razlučivost pročišćenih proteina spustiti ispod 10 ångströma. Rizzoli napominje da tim sada već može s razlučivošću od otprilike 10 ångströma određivati i oblik proteina koji su još unutar stanica.
„Nastojimo pristupačnim optičkim mikroskopima stvarati snimke slične onima krioelektronskih mikroskopa”
– kaže Shaib.
Rizzoli ipak naglašava da se tehnike poput mikroskopije s 1000-strukim povećanjem moraju prosuđivati prema tome koje biološke informacije mogu otkriti. „Mislim da nije bitna samo razlučivost, nego ono što se njome može vidjeti.”
Jeftinija mikroskopija?
Ranije tehnike superrazlučive svjetlosne mikroskopije omogućavale su razlučivost na razini ångströma, kaže Lothar Schermelleh, stručnjak za snimanje sa Sveučilišta u Oxfordu, ali strukturna informacija koju te metode pružaju ograničena je. „Ovo istraživanje mijenja sve. Promatranje GFP-a jednostavno je fantastično”, kaže stručnjak.
Kirti Prakash, računalni biolog sa Sveučilišta Ruskin, međutim je skeptičan u pogledu toga čuvaju li uzorci povećani 1000 puta u svakoj dimenziji doista svoje izvorne karakteristike, te smatra da bi se strukturne pojedinosti navedene u studiji trebale validirati i drugim metodama. „Ovo je jako cool, uzbudljiv rezultat. Ali osobno mislim da nisu otkrivene nove biološke činjenice”, kaže.
Milijardostruko povećanje bioloških uzoraka nosi jasne izazove. Pri takvim veličinama čak i proteini srednje veličine mogu ispuniti cijelo vidno polje mikroskopa, kaže John Danial, istraživač eksperimentalne fotonike sa Sveučilišta St Andrews. Zbog struktura visoke razlučivosti mnogo se čestica mora „usrednjavati”, pa istraživači moraju prikupiti veliku količinu slika kako bi rekonstruirali jednu proteinsku strukturu, objašnjava stručnjak.
Prema Huinim riječima, tehnika se može primjenjivati i uz automatizirano snimanje: čini se da gelovi danima čuvaju svoju veličinu bez skupljanja. Tehnikom se uz to mogu prikazati i proteini koji su premaleni za krioelektronsku mikroskopsku pretragu, dodaje.
Danial se unatoč svemu tome nada da će tehnike svjetlosne mikroskopije poput 1000-strukog povećanja ponuditi nov strukturni uvid u proteine i druge biomolekule te smatra da bi te metode mogle smanjiti ekonomske prepreke strukturne biologije. U Africi, primjerice, radi samo jedan krioelektronski mikroskopski objekt. Kako kaže istraživač:
„Mikroskopom od pet do deset tisuća dolara mogle bi se snimati proteini na strukturnoj razini. Takvi su mikroskopi dostupni i tamo gdje krioelektronski mikroskopi nisu.”
